無菌 藥品在使用前的無菌保證，是藥品管理法規的要求。因此，必須有容器完整性（Container Closure Integrity-CCI）的驗證和監測，以確保在無菌藥品生產，質控，運輸和儲存，乃至產品有效期的整個生命周期過程中，產品不受微生物的污染，確保病人用藥安全。目前各個國家的藥政法規，都有提供容器完整性CCI的測試方法，但是沒有提供具體細節，指導如何合理的選擇方法，及評價一個無菌藥品包裝系統( Container Closure System-CCS)的完整性。方法的合理選擇，以及科學的制定一個可接受的標準，和產品的性質和包裝系統密不可分。歐洲醫藥同盟多次開會探討容器完整性測試的最佳方法，卻得出結論，并不存在容器完整性測試的一個黃金標準，在考慮無菌制劑的既定用途和產品設計的基礎上，需要采取一個靈活的方法，來評估產品的包裝容器完整性。
美國藥典修訂了容器完整性測試（Container Closure Integrity Testing-CCIT）的通則方法USP<1207>。這個修訂緣于上世紀70年代的一個醫療事故，當時美國雅培工廠的一個靜脈輸注產品的包裝系統做了更換，在醫院注射此產品的病人廣泛爆發敗血癥，導致10%的病人因此死亡，經調查證實更換的包裝系統存在密封完整性的缺陷，使產品遭受微生物污染。這個悲劇事件，以及不斷提升的藥政監管要求，強調了制藥企業確保無菌制劑包裝完整性的重要性。
方法簡介和選擇依據
根據USP通則<1207>，將容器密封完整性測試的檢測方法分成確定性和概率性兩種類型。確定性檢測方法包括：高壓泄漏檢測法，激光頂空分析，氦氣泄漏測試，質子流法，壓力衰減法，真空衰減法，和Corona電極放電法。概率性檢測方法包括：氣泡發射法，色水法，和微生物挑戰法。
每個方法有其不同的靈敏度以及選擇參考點。制藥企業需要把包裝系統CCS作為藥品開發的關鍵質量屬性之一，用質量源于設計（Quality by Design-QbD）的理念，在藥品設計到生產的整個生命周期內，基于不同階段藥品有不同的應用目的，選擇合適的、CCIT方法。在選擇CCIT方法的時候，必須充分理解內包裝的材料特點，制作工藝參數，和操作中的控制方法。此外，對于容器密封性的可接受標準，在不同的產品發展階段也會有所不同。
在選擇一個合適的容器完整性測試CCIT方法的時候，需要考慮以下因素：
- 方法的既定用途，即，用于包裝系統的開發和確認，還是商業生產階段的過程控制或驗證，還是穩定性測試；
- 包裝系統開發前的認知，即，是開發該產品和包裝系統，還是改進一個新產品的包裝系統；
- 包裝系統的形式，即，小玻璃瓶，注射器，藥品和醫療器械的復合制劑，還是靜脈點滴用袋子；
- 包裝系統的材料，是延展性材料，玻璃，還是高分子聚合物；
- 藥品的類別，即，液體制劑，凍干粉制劑，小分子產品，還是大分子產品，水相制劑，溶劑制劑，還是油相制劑，產品導電性如何，產品黏度，頂空氣體的組成，常壓，還是真空包裝，或是過壓包裝；
- 測試時間長短的考量；
- 要求的方法靈敏度；
- 樣本做人工泄漏的可行性和人工泄漏方式
- 用于專屬研究的樣本量；
- 樣本制備的考量，以及樣本制備帶來的潛在風險，比如需要移除標簽，或需要排空小瓶，或需要清潔小瓶。
在很多情況下，包裝密封性測試方法的最初選擇，是基于某特定測試技術的經驗。隨著制藥企業經驗的積累，類似產品或包裝的參考，還有文獻的參考，以及行業標準和指南文件的指導，在產品開發到發展的整個生命周期，會采用不同的測試方法。在測試方法選擇上，還需要考慮以下因素：
?對測試樣本的破壞性還是非破壞性；
?測試的方法是內聯，在線，離線，還是近線；
?測試的有效性考量，包括測試速度（比如單位時間內的測試量），測試的產出（包括樣本平衡的時間和控制組的測量）
? 測試頻率和計劃：只需要測試一次還是需要多次，比如需要在穩定性方案中測試（氣體滲透的潛在影響）；
?測試成本，包括設備的購買，方法和設備的驗證，測試條件的維護成本；
?用于測試裝載的包裝系統，還是空載的包裝系統
?是否干擾藥品的理化測試；
?方法操作的特點：靈敏度，方法的耐用性，精密度，和準確度；
?測試結果的表述方式：通過/失敗（即，判定是否存在超過方法靈敏度的泄漏），泄漏位置的標記，還是能定量的測出泄漏孔的大小或泄漏流量；
? 泄漏樣品帶來的設備污染風險。
不管選擇哪個測試方法，測試儀器都需要經過校驗，測試方法也需要通過驗證，測試方法的系統適用性試驗，應該包括陽性控制（即已知泄漏的樣本）和陰性控制（即沒有人工泄漏的樣本）。
方法特點和應用范圍
下文將對各種常見測試方法的優缺點和應用范圍做詳細探討。
1）高壓泄漏檢測法
High-voltage leak detection
這是一種確定性的泄漏測試方法。高壓電檢漏是基于定量的電導測試，要求容器內灌裝的液體有一定的電導率，在待檢品上外加高壓電，泄漏點的存在導致樣品電阻的下降，從而導致電流的突躍，當然這個電流應該大于預先確認的方法檢測閾值（通過/失敗判定的靈敏度）。
該方法的優點：
- 不需要破壞樣本
- 可以做到在線測試
- 高速的測試
- 不需要測試前的樣品制備
- 其準確性獨立于員工的操作技能
- 在常壓下測試
該方法的缺點：
- 只有通過/失敗兩種結果，沒有定量的結果
- 藥品本身的電導應該大于包裝材料的電導
- 有可能破壞到產品（比如引起蛋白質的降解）
- 制劑液體必須不是易燃液體
- 測試過程會產生臭氧
- 對于特定的包裝系統，需要的固定裝置
- 電極必須離泄漏點在一定的距離內
- 藥品液體需要和泄漏點接觸或者非常靠近
- 產品堵塞泄漏孔會導致測試結果不準確
- 不適用于凍干粉制劑產品
該方法的應用范圍和建議：
- 對于商業化生產線的高產出的檢測。
- 需要評估產品接觸到高壓后的質量影響。
- 在長期穩定性樣品的泄漏測試上受限，這主要是由于長期儲存過程中液體風干堵塞泄漏孔。
- 產品的電導可能不足以檢測出泄漏
- 可以把在線檢測模式整合到自動目測檢查的生產線中。
- 在在線測試中依舊受到限制，這主要是由于方法有其靈敏度，只能測試到大于靈敏度的泄漏。
- 當泄漏點在小瓶的頂端位置，比如在閘蓋處，沒有和液體產品接觸到，該方法就不適用。
2）激光頂空分析
Laser-based headspace analysis
這是一種確定性的泄漏測試方法。激光法是通過監測容器頂空壓力、水汽和頂空氧變化來判定容器的完整性，原理是發射的激光穿透容器頂空，容器頂空的水汽和氧對激光有吸收，激光吸收量和對應的物質含量成正比。頂空水汽的吸收峰寬度和頂空壓力成正比，因此可以通過頂空水汽的吸收峰寬來獲得頂空壓力。
該方法的優點：
- 不需要破壞樣本
- 可以做到定量測試
- 可以做到在線測試
- 高速率的測試
該方法的缺點：
- 包裝容器必須是透明的
- 需要在包裝瓶的頂空有可以改變的氣體環境
- 需要頂空部位有一定的空氣體積供于檢測
- 在探測小尺寸的泄漏上，會延長測試的時間
- 變更設備的部件時需要包含所有不同的尺寸和型號
該方法的應用范圍和建議：
- 對于微米級孔徑大小的泄漏，測試可能需要耗時幾周的氣體交換。
- 測試方法方便使用
- 可用于評估瞬間發生的泄漏（比如測試需要低溫儲存的產品）
- 有可能導致錯誤的測試結果，尤其是在穩定性研究中，由于氣體的滲透或被液相吸收。
- 由于快速的和環境壓力平衡，大尺寸的泄漏可能無法測出（比如測試低溫儲存的產品）。
- 不容易區別出不同尺寸的泄漏。
- 不容易甚至不能夠測試出在液面下的泄漏，因此，只適用于預灌注注射器。
- 凍干粉制劑產品可能會導致泄漏的堵塞。
- 有部分的壓力依賴于溫度。
3）真空衰減法
Vacuum decay
這是一種確定性的泄漏測試方法。真空衰減法是將包裝容器置于專門的測試腔體內，對測試腔體抽真空，容器內外壓差使得容器內部氣體通過漏孔泄漏進入測試腔體，主機壓力傳感器監測到壓力的變化，將壓力變化值和參考值做比較，壓力增大說明存在泄漏，以判定容器密封完整性是否格。此方法的測試步驟包括：抽真空、保壓和測試。
該方法的優點：
- 不需要破壞樣本
- 可以做到在線測試
- 高速率的測試和產出
- 測試不會影響生產進度
- 有ASTM方法可供參考（ASTM-American Society for Testing and Materials）
- 可適用于液體和凍干粉的制劑
- 可應用于有色包裝瓶和貼好標簽的包裝瓶檢漏
該方法的缺點：
- 儀器昂貴，每種包裝系統需要特定的儀器腔體
- 產品堵塞泄漏孔的情況下會檢測不出泄漏
- 真空腔體的準備至關重要（濕度會影響測試結果）
該方法的應用范圍和建議：
- 此方法適用性很廣，可用于支持產品開發，商業化，以及穩定性研究各階段，包裝容器的密封性檢查。
- 適用于液體和凍干粉的制劑。
- 可應用于包裝器械的測試，和貼好標簽的包裝瓶檢漏。不過，相對于未貼標簽的初級包裝，其檢測靈敏度是降低的。
- 只限于在線測試，并會產生假陽性結果（比如，當有滯留氣體在閘蓋處時；或者受到濕度波動的影響時）。
- 方法開發研究表明，該方法對凍干粉，預灌注液體的注射器，和小容量瓶液體制劑具有等同的靈敏度。
- 當應用于液體制劑時（黏度限制），鐳射穿孔的陽性控制樣本容易出現堵塞的情況；對預灌注注射器，細孔也很容易被蛋白質或硅油堵塞。
- 壓力變化和泄漏的尺寸，泄漏的速率有量級的相關性。然而，無法區分泄漏是來自于多個泄漏小孔還是單個，或者是包裝連接處的裂縫。
4）微生物挑戰法(浸入或氣溶膠挑戰)
Microbial immersion or aerosol challenge
這是一種概率性的泄漏測試方法，此檢查通常與模擬灌裝同時進行。通過按照模擬灌裝驗證方案進行培養基模擬灌裝，然后進行壓塞軋蓋后，目檢合格，經已驗證的滅菌柜滅菌后，將容器密封面浸入到高濃度的菌液中，使樣品容器內的培養基充分接觸封口內表面，樣品的頸部及封口的外表面應*浸泡在菌懸液中，浸泡一定時間后取出，定期培養后檢查是否有微生物侵入，以確定容器密封系統的完整性。同時，需要做陽性對照試驗，確認培養基的促生長能力。測試中通常會運用真空或過壓的挑戰條件。
該方法的優點：
- 數十年來獲得廣泛應用。
- 是整個行業和法規熟識的做法。
- 可以與模擬灌裝結合，同步進行。
- 對產品特性的直接評價（即，確保容器密封性可以使產品免受微生物污染）。
該方法的缺點：
- 對樣品的破壞性。
- 只有通過或失敗的結果，沒有定量測試。
- 不可能進行100%的樣本測試。
- 測試會耗時數周。
- 需要比較多的勞動力。
- 只能適用于可以做培養基罐裝的包裝系統。
- 可能會導致假陽性或假陰性的結果；測試的靈敏度部分依賴于分析員的操作技巧。
- 對于微小瑕疵，測試具有隨機性。
- 不同國家地區，對于培養基，所用菌種和測試方法還沒有統一。
該方法的應用范圍和建議：
- 此方法的檢測限隨著以下因素波動：泄漏的大小，包裝材料，菌種，培養基和挑戰條件。
- 一直被用來建立關鍵的泄漏點（根據其泄漏的速率或大小）。
- 浸入法比氣溶膠挑戰法更普遍，方法條件更容易達到，有更好的重復性。
- 不使用真空或過壓的條件，自然放置幾周時間再檢查，更具有代表性，不過耗時。
- 如果使用真空或過壓的條件，可以加速測試，數小時內就可以做檢查，這種方式可以代表運輸條件，減少測試時間。
5）染色浴法
Dye ingress
這是一種概率性的泄漏測試方法。將密封容器*浸沒在染色浴中，也可在染色浴中加入表面活性劑，對整個測試腔體進行抽真空。如果該容器有裂縫，空氣就會從瓶中溢出。然后解除真空，這時泄漏容器內存在負壓，染色溶液會從裂縫中進入瓶內部，再對測試腔體加正壓，提高染色液的滲入性，通過分析員或儀器目檢剔除變色的容器。
該方法的優點：
- 數十年來獲得廣泛應用。
- 有ASTM和ISO的標準方法。
- 是整個行業和法規熟識的做法。
- 基礎并且有效率。
- 可靈活應用，同時測試不同包裝容器的泄漏情況。
- 可以看出泄漏的位置。
- 泄漏位置可以在液相中。
該方法的缺點：
- 對樣品的破壞性。
- 只有通過或失敗的結果，沒有定量測試。
- 不可能進行100%的樣本測試。
- 必須是透明的包裝系統，用于目測判斷。
- 如果樣品體積本身比較大，只進入很少的染色水，有時不容易分辨出來。
- 對于微小瑕疵，測試具有隨機性。
該方法的應用范圍和建議：
- 方法具有多用途，可以測試初級包裝和外包裝，用來支持產品開發階段，商業化生產，和穩定性研究階段的檢漏測試。
- 直接檢測相關泄露
- 可以運用不同的染色劑。
- 如果運用優化的真空/加壓循環工藝，可以提高測試的靈敏度。方法的檢測限隨著以下因素波動：泄漏的大小，包裝材料，染色液的濃度，和挑戰條件。
- 染色液必須是易混合的而且不和產品發生化學反應。
- 可以把同樣的挑戰條件應用到微生物侵入試驗法中。
- 對于液體制劑應用良好，但基于染色液的限制，可能對凍干制劑不適合 。
人工穿孔的技術討論
上述討論的檢漏方法，都需要做方法驗證，需要有明確泄漏的樣本來做陽性控制，以挑戰方法的檢漏能力。對于樣品的人工穿孔，有以下幾個常用的方法：
- 鐳射穿孔，直接穿透包裝容器本身
- 鐳射穿孔，穿透在和包裝容器相連的金屬片或管 （laser drilling into a metal plate or tubing that is integrated to a CCS ）
- 微米級的金屬絲插入到容器中
- 微量吸管插入到膠塞或連接到容器的一個人工小孔上
- 毛細管（熔融硅，鎳或玻璃）插入到膠塞或連接到容器的一個人工小孔上。
每一種方法都有其挑戰性，包括穿孔尺寸的限制，穿孔形狀不規則，穿孔大小難以測量，微小穿孔容易被立即堵上，造價高等等。目前行業內沒有標準來規定穿孔技術和孔徑測試的方法。在建立容器密封性測試方法的時候，每個公司需要對自己建立的方法做合理性的說明，采用適當的方法。
結論
隨著修訂版USP<1207>的執行，對于包裝容器密封性測試（CCIT）會有更多深入的調查，生產無菌制劑的企業需要符合不斷發展的法規期望。對于CCIT的測試方法和可接受標準，目前行業給予企業一定的靈活性。正如上述討論，每個方法都有其優缺點和適用性，市面上的測試儀器也有其各自的優缺點，因此，制藥企業有責任根據產品自身的特點和產品的不同發展階段，采用風險評估的方法，選取并驗證合適的檢漏測試方法，并建立泄漏的可接受標準。
表1. 五種泄露檢測法綜合評價
表2. 五種泄露檢測法詳細描述
